Skip to content

Wysokie miana wirusa cytopatycznego w osoczu pacjentów z objawową pierwotną infekcją HIV-1 czesc 4

3 miesiące ago

513 words

Następnie frakcję osocza odwirowano przy 1000 xg przez 10 minut, aby zapewnić usunięcie wszelkich szczątkowych resztek komórkowych lub płytek i przepuszczono przez sterylny 1,2-.m nie wiążący białka filtr, który został wstępnie zaabsorbowany przez RPMI 1640 zawierający 15% płodu. surowica cielęca. Odfiltrowane osocze seryjnie rozcieńczono od 100 do 10-8 za pomocą RPMI 1640 zawierającego 15 procent płodowej surowicy cielęcej. Próbki po mililitrze każdego rozcieńczenia osocza (100 do 10-8) hodowano w 12-studzienkowych płytkach z PBMC o normalnej dawce 2 x 106 Typ 0, które stymulowano fitohemaglutyniną (PHA, 2 ug na mililitr) przez 48 do 72 godziny, przemyto i ponownie zawieszono w kompletnej pożywce (RPMI 1640 z 30 U interleukiny-2 na mililitr, 0,1 mg gentamycyny na mililitr, 2 mM L-glutaminy i 15 procent płodowo-cielęcej surowicy). Wirus hodowano również z x 106 komórek PBMC od pacjentów do 4 przez współhodowlę z PBMC o stałym pobraniu stymulowanym x 106 PHA. Wszystkie hodowle utrzymywano przez pięć tygodni z podziałami komórek 1: 3 przeprowadzanymi co tydzień. Supernatanty badano co tydzień pod kątem antygenu p24 HIV-1 w komercyjnym teście ELISA typu sandwich w fazie stałej (Abbott Laboratories, North Chicago). Pozytywne hodowle zdefiniowano jako te, dla których wartości absorbancji były większe niż 2 SD powyżej wartości dla próbek od zdrowych osobników (> 30 .g antygenu p24 na mililitr) i wartości, które wzrosły podczas przebiegu hodowli, odzwierciedlając aktywną replikację wirusa. Ostateczne miano punktu końcowego w osoczu, wyrażone jako dawka infekcyjna z hodowli tkankowej (TCID) na mililitr osocza, określono jako najwyższe rozcieńczenie osocza, które dało hodowlę dodatnią. Pozytywne hodowle ekspandowano w kolbach do hodowli tkankowych T75 przez dodanie niezakażonych normalnych limfocytów dawcy. Wirus pozbawiony komórek i zainfekowane komórki poddano kriokonserwacji w celu późniejszej analizy i klonowania molekularnego. Oznaczenie ilościowe antygenu p24 HIV-1 osocza i przeciwciała przeciwko HIV-1
Osocze zbierano w czasie każdej upuszczania krwi i przechowywano w temperaturze -70 ° C do późniejszego oznaczania poziomów antygenu p24 (Abbott) i przeciwciała przeciw HIV-1 przez ELISA z całymi przerywanymi wirusami (Organon Teknika, Durham, NC) i Western immunoblotting ( EI DuPont, Wilmington, Del.). Poziomy antygenu p24 mierzono w duplikatach próbek osocza traktowanych 0,5% Tritonem X-100, zgodnie ze standardami dostarczonymi przez producenta. Pozytywne próbki neutralizowano surowicą HIV-1, aby zapewnić swoistość. Każde z tych badań przeprowadzono w seriach z pojedynczą serią odczynników testowych, pozwalając na porównanie reaktywności antygenu HIV-1 i przeciwciała bezpośrednio między pacjentami i pomiędzy próbkami od poszczególnych pacjentów.
Biologiczne i molekularne analizy wirusa HIV-1
Charakterystykę replikujących i cytopatycznych właściwości izolatów HIV-1, analizę metodą cięcia metodą Southern blot i klonowanie molekularne pełnej długości zintegrowanego prowirusowego DNA HIV-1 przeprowadzono w sposób opisany w innym miejscu.15 16 17 18 19
Wyniki
Ryc. 1. Ryc. 1. Zmiany w wirusie osocza, antygenie p24 i miana przeciwciał podczas pierwotnej infekcji HIV-1. Miana wirusa (kwadraty) w osoczu wyrażono jako dawki infekcyjne dla hodowli tkankowej (TCID) na mililitr, miana antygenu p24 (pełne kółka) jako pikogramy na mililitr, a miana przeciwciał (puste kółka) jako stosunki absorbancji ELISA do wartości odcięcia.
[przypisy: rutinoscorbin skład, co powinna zawierać apteczka, dakolen ]

0 thoughts on “Wysokie miana wirusa cytopatycznego w osoczu pacjentów z objawową pierwotną infekcją HIV-1 czesc 4”